诊断类固醇5α-还原酶2缺乏症不是一件容易的事情，所有青春期前的男性假两性畸形或男性假两性畸形在青春期出现男性化又没有男子乳房发育的患者，都要考虑存在本病的可能性，确定诊断的关键是证实T/DHT比值升高。
类固醇5α还原酶Ⅱ缺乏的诊断主要依据典型的临床表现，家族史和特征性的内分泌变化，青春期前患儿不易诊断，特别是缺乏家族史资料时，如患者外生殖器两性畸形，小阴茎，会阴阴囊型尿道下裂，睾丸位于腹股沟管或阴唇阴囊褶内，染色体核型46，XY，高度怀疑本病时，可通过HCG试验明确诊断，方法为HCG 2000U，隔日肌内注射1次，共3次，注射前后测定血浆睾酮，DHT和(或)尿5β-4氢皮质醇(5β-THF)，5α-4氢皮质醇(5α-THF)，5β-4氢皮质酮(5β-THB)，5α-4氢皮质酮(5α-THB)，原胆烷醇酮(ETI)和雄素酮(AND)，本病患者注射后的T/DHT比值或5β-THF/5α-THF，5β-THB/5α-THB和ETI/AND比值都显著高于正常同龄儿童，5β-类固醇代谢物/5α-类固醇代谢物比值的变化主要是因为肝脏5α-还原酶活性的反应，它们主要是在肝内代谢形成，少部分是在外周组织代谢。
在青春期前患者肌注绒促性素(HCG)1500 U/(m2·d)，连续3天，正常男性婴儿(17天至6个月)的T/DHT比值为5.2±1.5，青春期前男孩(6个月至14岁)为11±4.4，而本病患者则显著增高，青春期后T/DHT比值的正常范围为12±3.1，而本病患者比值为35～84。
