由于棘阿米巴性巩膜炎少见，常误诊，即使首先考虑巩膜棘阿米巴感染，诊断仍很难证实，详细询问病史，裂隙灯检查，对涂片或活检组织进行特殊染色和用大肠杆菌性无养分培养基培养，可以早期诊断，常规角膜上皮涂片找不到棘阿米巴或棘阿米巴培养阴性，因为棘阿米巴仅存在于角膜基质内。
主要与单孢病毒性巩膜炎相鉴别，眼剧痛与体征不一致，抗病毒治疗无效，组织培养和活检有棘阿米巴原虫为其诊断鉴别要点。
