肺炎衣原体肺部感染的临床症状及X线表现均无特异性，不能和其他非典型肺炎相区别，尤其是肺炎支原体肺炎，故确诊有赖于实验室诊断，最可靠的方法是进行肺炎衣原体的培养，取鼻咽部或咽后壁拭子，气管和支气管吸出物，肺泡灌洗液等标本培养，最近有报道经胰酶和(或)乙二胺四乙酸钠(EDTA)处理后的标本肺炎衣原体分离率大大提高，分离物可用肺炎衣原体种特异性单克隆抗体进行鉴定，但由于肺炎衣原体的培养要求高，一般实验室难以做到，应用PCR试验对上述标本进行检测对诊断有很大帮助，但需要注意质量控制，防止出现假阳性结果，微量免疫荧光试验(MIF)是目前国际上标准的且是最常用的肺炎衣原体血清学诊断方法，除性病门诊患者和娼妓特定人群外，肺炎衣原体肺炎的MIF血清学诊断可使用肺炎衣原体单一抗原，即不需要同时检测沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体抗体，血清学诊断标准为：MIF试验IgG≥1∶512和(或)IgM≥1∶32，在排除类风湿因子(RF)所致的假阳性后可诊断为近期感染，双份血清抗体滴度4倍或以上升高也诊断为近期感染，1∶16≤IgG<1∶512为既往感染。
应注意与支原体肺炎和病毒性肺炎相鉴别，这两种肺炎的临床症状和X线胸片改变与肺炎衣原体肺炎非常相似，鉴别诊断依赖于实验室检查。
