除流行病学及临床特点支持外，从大便中发现O157∶H7大肠埃希杆菌及其毒素才能确诊，其鉴定方法有：
1.细菌培养分离 提高大便培养阳性率就能提高确诊率，影响培养的因素，主要是大便性状，病程及培养基的选择，血性便，病程短者，阳性率高;水样便，病程长，尤其超过7天者，阳性率低，山梨醇-麦康凯琼脂(SMAC)可提高阳性率。
2.免疫学检测 用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157∶H7大肠埃希杆菌。
3.基因检测 应用EHEC特异性DNA探针，其敏感性，特异性均可达99%;或应用PCR对EHEC DNA序列分析，发现其溶血素AB基因为EHEC特有，其特异性强，敏感快速，3～4h可出结果，其他尚有对SLT1，SLT2两对寡核苷酸引物同时扩增的多重PCR法，但尚未在临床广泛应用，基因检测可用于临床研究与流行病学调查。
应与其他大肠埃希杆菌肠炎相鉴别。
