1.尿苯丙酮酸试验：由于患儿尿中排出苯丙酮酸增多，可作定性试验，方法有：
(1)三氯化铁试验：将5%三氯化铁滴入5ml尿中立即出现绿色反应则为阳性，新生儿尚未喂食，此试验呈阴性，枫糖尿病者尿也可呈阳性，故此试验特异性较差。
(2)2，4-硝基苯肼试验：如果产生黄色混浊沉淀则为阳性。
2.血苯丙氨酸测定：正常人血中苯丙氨酸为60～180μmol/L，PKU患者可高达600～3600μmol/L，如果以258μmol/L为正常人与PKU病人的分界点，则有高达4%的假阳性，用色层析法则在生后几天的新生儿中可出现假阴性，MS/MS法可减少假阳性率，此方法可同时测定血苯丙氨酸和酪氨酸，并可计算苯丙氨酸/酷氨酸比值，如果以比值2.5为正常儿童与患PKU者的分界点，则可将假阳性减少到1%，故目前多用此方法来筛选新生儿苯丙酮尿症，此方法还可用来筛选半乳糖血症，枫糖尿病，同型胱氨酸尿症和先天性甲状腺功能减低症，一次检查可以筛选多种先天性疾病。
3.脑电图(EEG)：主要是棘慢波，偶见高波幅节律紊乱，EEG随访研究显示，随年龄增长，EEG异常表现逐渐增多，至12岁后EEG异常才逐渐减少。
4.产前检查：由于绒毛及羊水细胞测不出苯丙氨酸羟化酶活性，所以产前诊断问题长期不能解决，目前我国已鉴定出25种中国人PKU致病基因突变型，约占我国苯丙氨酸羟化酶突变基因的80%，已成功用于PKU患者家系突变检测和产前诊断。
5.X线检查：可见小头畸形，CT和MRI可发现弥漫性脑皮质萎缩等非特异性改变。
