1.标本采集
男性患者可取泌尿生殖道分泌物，前列腺液，精液，定量培养可取初段尿，中段尿，女性除宫颈和阴道拭子外，羊水，尿道分泌物也可用于检测，若要测特异性抗体，可采集血液标本，标本采集后应尽快送检，一般不超过3h，因支原体无细胞壁，对干燥特别敏感，且代谢产物积累不利于其生长繁殖。
支原体的实验室诊断有培养，特异性抗体检测，代谢抑制试验，DNA探针和PCR技术等，以培养最为可靠，PCR技术最为敏感。
2.分离培养
按患者性别和病变部位不同，分别在无菌条件下采取不同的标本，立即接种于液体培养基中，液体培养基颜色发生变化时就转种到固体培养基。
3.特异性抗体检测
生殖支原体感染部分患者可测出抗体，但敏感性不高，重复性差，未能用于临床，采用ELISA法可检出解脲脲原体的IgM和IgG抗体，较敏感，特异性强，有早期诊断意义。
4.DNA探针技术
此法敏感，因需同位素，难以推广应用。
5.PCR技术
由于其敏感性高，特异性好，现已从实验研究阶段进入临床应用阶段，逐步成为临床快速诊断的重要手段。
内镜检查，可直接观察泌尿生殖系统炎症病变。
