诊断比较困难，必须与细菌性角膜溃疡进行鉴别，有农业性眼外伤史，典型的临床表现，是诊断的主要依据，再者，疑为真菌感染时，应作角膜病变处刮片，将取下的坏死组织放于玻片上，滴5%氢氧化钾一滴，覆盖破片，立即镜检，寻找真菌菌丝，有条件时应进行真菌培养。
1.刮片检查
(1)取材：表面麻醉(最好应用0.5%丙氧苯卡因，因该药较其他表面麻醉剂的抑菌作用轻)后，用圆刃刀片从病灶深部或边缘刮取组织。
(2)染色法：常用的方法有革兰染色法，Giemsa染色法及KOH湿片法，有时也可采用特殊真菌染色法(Gomori mefhenamine)，其染色的阳性率分别为55%，66%，33%及85%，革兰染色最为简单，真菌呈革兰阳性(深紫色)，其他组织为阴性(红色)，KOH湿片法是利用KOH溶解刮片中的非真菌杂质而显示菌丝，有报道同时加入亮绿，甲绿或墨水染色(10%氢氧化钾和墨汁以9∶1的比率混合而成的混合液)能增加对比度，光镜下可见真菌细胞壁有墨水或绿色小颗粒附着，而胶原纤维及炎性细胞则未着染，对比强烈，容易识别，缺点为易出现假阳性或假阴性，最近有人采用caleofluor-white染色(CFW染色)，此染色剂能与真菌细胞壁的壳多糖和纤维素紧密结合，在荧光显微镜下真菌显示强烈的深绿色。
2.真菌培养
刮片检查简单而迅速，但只能确定是真菌，而不能鉴别真菌菌种及进行药敏试验，因此，还必须进行真菌培养，常用的培养方法及培养温度如下。
(1)血琼脂(blood agar)，25℃及37℃下培养。
(2)sabouraud葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。
(3)马铃薯葡萄糖琼脂，25℃及37℃下培养。
多数酵母菌易在血琼脂中生长，丝状菌易在sabouraud琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂生长(注意镰刀菌在37℃时，2～3天即可生长，而其他真菌在37℃时，则需要1周以上时间才能生长)。
3.聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction，PCR)
国外已有将临床分离出的真菌进行体外培养，并应用PCR技术进行分型诊断，认为PCR技术对于角膜真菌的快速诊断有良好的应用前景，但需要解决假阳性结果的问题。
4.应用几丁质鉴别真菌
Lamps(1995)指出几丁质是在真菌和节肢动物中含有的多糖结构，而在哺乳动物中缺乏，真菌细胞壁的几丁质成分随着菌种的不同而不同，因此具有很高的特异性，不同荧光标记的凝集素可以与不同几丁质特异性结合，发出特异荧光，以快速诊断并鉴别菌种，国外目前认为此技术为快速特异的真菌诊断手段，国内尚未见报道。
5.角膜活检
当刮片和培养均为阴性结果，临床仍然怀疑真菌感染时除应反复多次进行检查外，还应做角膜活检，用尖刀片切取病灶组织，或用穿透性角膜移植术钻取的病灶组织，石蜡包埋固定后作病理切片，然后染色镜检，光镜检查的染色法有：PAS染色，HE(苏木精-伊红)染色及抗酸染色等;荧光显微镜检查有吖啶橙(acridine orange)染色及CFW染色，组织学上所见：
(1)“菌丝苔被”是由大量中性粒细胞浸润，角膜基质层的凝固性坏死及胶原纤维肿胀所构成，很少见到完整的真菌。
(2)菌丝苔被病灶周围有大量菌丝，菌丝沿角膜板层平行蔓延，也可垂直穿通角膜小板向前向后生长，并穿过后弹力膜到达前房或后房引起炎症反应。
(3)“羽毛状边缘”是圆形细胞及浆细胞浸润，并非是真菌的菌丝。
6.共焦显微镜(confocal microscope)
共焦显微镜是20世纪90年代中期新兴的一种活体非创伤性的角膜疾病检查方法，可以从细胞水平观察角膜的不同层次结构，已应用于HSK和棘阿米巴角膜炎的诊断，Winchester(1997)应用共焦显微镜观察曲霉菌性角膜炎，角膜中可见高清晰度的菌丝直径6µm，长60～40µm，在时间，敏感性，安全性方面，共焦显微镜都明显优于以往任何一种诊断方法。
