1.直肠肌层活检
Swenson(1955)最先采用该法，准确率为98%，从直肠壁取肌层活检，证实肌间神经节细胞缺如诊断先天性巨结肠，理论上是最可靠的方法，但因存在一些缺点，故目前并非必要：
①Smith(1968)经组织学检查发现，生后神经节细胞有一发育和成熟过程，直肠肌间丛尤其明显，黏膜下丛又落后几周，如不注意，可把正常儿诊断为先天性巨结肠或同源病，
②正常直肠在齿状线上方有一低神经节细胞区，在该区内取材可把正常儿诊断为先天性巨结肠或同源病，故强调取材高度在齿状线上方至少新生儿2cm，1岁以内2.5cm，1～3岁3cm，4岁以上3.5cm，如此，短段型巨结肠病儿又易漏诊，
③小儿肌层活检有肠穿孔，出血，感染等并发症，术后瘢痕可影响根治性手术，新生儿因肛管狭小，直肠壁薄，操作不便等，更易发生并发症。
另外，肌层活检是诊断先天性巨结肠同源病的主要根据。
2.直肠黏膜活检
直肠黏膜活检仅吸取一小块黏膜，经不断改进，该法简单，安全可靠，可不需麻醉，不必住院，检查方法有组织学，组织化学及免疫组织化学，组织学检查主要用HE染色判断神经丛中神经节细胞的有或无，该法简单，但不准确；乙酰胆碱酯酶等组织化学检查方法，需要新鲜组织标本和冷冻切片机等技术条件，新生儿期因乙酰胆碱酯酶活性较低，易出现假阴性结果；免疫组织化学方法准确性高，但因试剂昂贵，目前尚不适于做常规诊断方法，王怡平等(1991)采用神经元特异性稀醇化酶(NSE)免疫组化法，检查32例怀疑先天性巨结肠病儿，无一例误诊；徐本源等(1995)用NSE和S-100蛋白，诊断先天性巨结肠，准确率达100%，NSE为神经节细胞内酶之一，是神经节细胞的标志，NSE抗体与神经节细胞及神经纤维内NSE结合，使神经组织清晰可见，发育未成熟的神经节细胞也容易辨认，并容易与炎性细胞，淋巴细胞，施万细胞，巨噬细胞和血管内皮细胞等区别；S-100蛋白是一种神经系统周围成分的标记物，应用NSE和S-100蛋白两种组化方法，异途同归，互为佐证，尤其是对新生儿期先天性巨结肠，有重要诊断价值，我们(1998)应用免疫组化技术，检测30例先天性巨结肠的无神经节细胞段和正常段肠管中P75NGFR的分布情况，认为该法操作简单，结果准确，可用于诊断先天性巨结肠，目前，同济医科大学，上海第二医科大学及中国医科大学都开展了组织化学及免疫组化检查。
3.X线钡剂灌肠
X线下钡剂灌肠是判定病变范围和选择术式的重要依据，钡剂灌肠目的是显示痉挛段及其上方的扩张段，因此确认扩张段即可，不要过多灌入钡剂继续向上检查，以免加重病儿腹胀及其危险。
痉挛段范围在降结肠以下者，侧位显示最清，故一般仅摄带肛门标记的侧位X线片，但痉挛段达乙状结肠时从正位观察才能全面，X线钡剂灌肠的诊断率，目前仍徘徊在90%左右，其原因主要有3个：①新生儿巨结肠确诊困难，一般认为新生儿巨结肠的形态学改变，生后2周才形成，有的需要3～4周甚至几个月，尽管开展了灌肠后24～48h，动态观察钡剂贮留或排泄的功能性改变，但梗阻症状很重时，钡剂灌肠后必须洗肠或手术，不允许延迟观察；并发肠炎时，难于保留钡剂达24h以上，②对短段型先天性巨结肠，尤其是超短段型先天性巨结肠，难与特发性巨结肠鉴别，③对特殊型先天性巨结肠易于漏诊或误诊。
4.直肠肛管测压
是诊断先天性巨结肠的有效方法，具有经济，简便，快速而安全，以及无损伤性，可反复检测等优点，关于测压诊断先天性巨结肠的准确率，文献报道不一(76%～100%)，研究证明，正常儿直肠内气囊注入2～3ml气体后，1～3s内肛管压力迅速下降(称正常反射)，而先天性巨结肠病儿，向直肠内气囊注入很多气体，肛管压力都不变(称阴性反射)，即无直肠肛管反射或无正常反射，有的先天性巨结肠病儿，肛管压力不但不下降，反而上升(称异常反 射)(图3)，阴性反射和异常反射统称为病理反射，经检测156例慢性便秘病儿，直肠肛管测压的准确率为93.33%，其中误诊率为2.88%(104例病理反射者，3例除外先天性巨结肠：2例为新生儿，6个月后复查正常；另1例为胎粪性腹膜炎)，漏诊率为7.69%(52例有正常反射者，4例为先天性巨结肠病儿)，为提高测压诊断的准确性，必须注意检测方法和判断标准。
直肠肛管测压诊断新生儿巨结肠应当慎重，有作者动态检测50例正常新生儿，仅13例于生后第1天出现正常反射，48例(96%)在生后1周内出现正常反射，另2例因出院未能连续检测，分别在生后100天和8个月测检时出现正常反射，理论上应该说，新生儿生后自动排便，标志有直肠肛管反射，但经测压观察，我们认为这种刚刚形成或建立的反射，并未成熟也不稳定，故测检中不易显示或捕捉。
目前一致认为，诊断和鉴别超短段先天性巨结肠与特发性巨结肠的最可靠方法，是直肠肛管测压检查。
