1.新生儿筛查
新生儿期的PKU患儿无任何临床表现，生后3个月后才渐渐出现PKU的表现，随着预防医学科学的发展，苯丙酮尿症的新生儿筛查已逐步成为常规，新生儿筛查即是通过测定血苯丙氨酸，在群体中对每个新生儿进行筛检，使PKU患儿在临床症状尚未出现之前，而其生化等方面的改变已比较明显时得以早期诊断，早期治疗，避免智能落后的发生， 2.尿三氯化铁(FeCl3)及2,4-二硝基苯肼试验(DNPH)
(1)三氯化铁(FeCl3)试验：在新鲜尿液5ml加入0.5ml的FeCl3，尿呈绿色为阳性。
(2)2,4-二硝基苯肼试验：在1ml尿液中加入1ml的DNPH试剂，尿液呈黄色荧光反应为阳性。
这两种试验阳性反应也可见于枫糖尿症，胱氨酸血症，故并非为PKU特异性试验，需进一步做血苯丙氨酸测定才能确诊，新生儿PKU因苯丙氨酸代谢旁路尚未健全，患者尿液测定为阴性，该方法不能用于新生儿筛查。
3.血苯丙氨酸测定 有两种方法：
(1)Guthrie细菌抑制法：正常浓度<120μmol/L(2mg/dl)，PKU>1200μmol/L。
(2)苯丙氨酸荧光定量法：正常值同细菌抑制法。
4.苯丙氨酸负荷试验
对血苯丙氨酸浓度大于正常浓度，<1200μmol/L者口服苯丙氨酸100mg/kg，服前，服后1，2，3，4h分别测定血苯丙氨酸浓度，血苯丙氨酸>1200μmol/L诊断为PKU，<1200μmol/L，为高苯丙氨酸血症。
5.HPLC尿蝶呤图谱分析
10ml晨尿加入0.2g维生素C，酸化尿液后使8cm×10cm新生儿筛查滤纸浸湿，晾干，寄送有条件的实验室分析尿蝶呤图谱，进行四氢生物蝶呤缺乏症的诊断和鉴别诊断。
6.口服四氢生物蝶呤负荷试验
在血Phe浓度>600μmol/L情况下，直接给予口服BH4片20mg/kg，BH4服前，服后2，4，6，8，24h分别取血作Phe测定，对于血Phe浓度<600μmol/L者，可作Phe+BH4联合负荷试验，即给患儿先口服Phe(100mg/kg)，服后3h再口服BH4，服Phe前，后1，2，3h，服BH4后2，4，6，8，24h分别采血测Phe浓度，BH4缺乏者，当给予BH4后，因其苯丙氨酸羟化酶活性恢复，血Phe明显下降，PTPS缺乏者，血Phe浓度在服用BH4后4～6h下降至正常;DHPR缺乏者，血Phe浓度一般在服BH4后8h或以后下降至正常;经典型PKU患者因苯丙氨酸羟化酶缺乏，血Phe浓度无明显变化。
辅助检查
1.脑电图
约80%病儿有脑电图异常，可表现为高峰节律紊乱，灶性棘波等。
2.CT和MRI检查
患者头颅CT或磁共振影像(MRI)可无异常发现，也可发现有不同程度脑发育不良，表现为脑皮质萎缩和脑白质脱髓鞘病变，后者在MRI的T1加权图像上可显示脑室三角区周围脑组织条形或斑片状高信号区。
3.智力测定
评估智能发育程度。
